液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）已成為許多具有挑戰(zhàn)性的分析的首xuan分析技術(shù)，基于其選擇性，靈敏度和對不同極性化合物的廣泛適用性。盡管該技術(shù)具有優(yōu)勢，但LC-MS系統(tǒng)的復(fù)雜性常常使分析人員難以滿足方法檢測限制。在“Column Watch”的這一部分中，討論了幾種策略，通過減少污染物，仔細(xì)選擇LC方法條件以及優(yōu)化MS接口設(shè)置來提高方法靈敏度。通過了解這些參數(shù)與電離效率之間的關(guān)系，分析人員可以提高其信噪比并實(shí)現(xiàn)LC-MS技術(shù)的隱藏潛力。

        在質(zhì)譜（MS）中，術(shù)語靈敏度可具有通?？苫Q使用的若干含義。靈敏度可定義為每單位分析物濃度變化的信號變化（例如校準(zhǔn)曲線的斜率）^[1]。更常見的是，它用于參考MS檢測器中分析物產(chǎn)生的信號的大小。在后一種用法中，MS靈敏度通常用于比較檢測器。

        從根本上說，檢測器提供定量數(shù)據(jù)的能力是分析物的信噪比（S / N）的函數(shù)。檢測限（LOD）由分析物S / N確定，是物質(zhì)的低濃度，其信號可與系統(tǒng)噪聲區(qū)分開來^[2]。如圖1所示，如果背景噪聲保持不變，則MS的靈敏度越高，給定方法LOD的S / N值越大。因此，通過操縱S / N可以發(fā)生靈敏度的提高。MS優(yōu)化，樣品預(yù)處理策略，流動相組成和LC色譜柱特性都是電離效率*的，并且在優(yōu)化時會改善分析物信號。同樣，限制有助于信號抑制或加合物形成的污染物也可以增強(qiáng)響應(yīng)。

MS優(yōu)化

        在液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）中，靈敏度直接關(guān)系到從溶液中的分析物產(chǎn)生氣相離子的效率（電離效率）以及將它們從大氣壓轉(zhuǎn)移到MS系統(tǒng)的低壓區(qū)的能力。 （傳輸效率）^[3]。電離和傳輸效率的優(yōu)化取決于LC方法參數(shù)和目標(biāo)分析物或分析物。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，有必要對MS源中發(fā)生的機(jī)制有基本的了解。

        電噴霧電離（ESI）是zui流行的電離技術(shù)之一; 因此，它將成為本專欄文章的重點(diǎn)。然而，重要的是要注意，無論選擇何種電離模式，都必須優(yōu)化源參數(shù)。當(dāng)LC流動相流入樣品毛細(xì)管時，基于所選擇的極性分離正離子和負(fù)離子。在正ESI中，負(fù)離子在毛細(xì)管壁上被中和，并且正離子在流動相中繼續(xù)到毛細(xì)管，其中帶電分析物累積成液滴。在施加電壓的影響下，形成泰勒錐[4]。靜電排斥導(dǎo)致錐體破碎成小的帶電液滴，然后，在毛細(xì)管和采樣板之間施加的電位差的引導(dǎo)下，它朝向采樣孔行進(jìn)。隨著微小液滴向孔口前進(jìn)，溶劑在干燥氣體和熱量的作用下蒸發(fā)，導(dǎo)致液滴表面積減小，電荷密度增加。終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子^[5]。形成的離子云被稱為 終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子^[5]。形成的離子云被稱為 終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子^[5]。形成的離子云被稱為離子羽。

        選擇合適的極性是開發(fā)靈敏的LC-MS方法的步。選擇毛細(xì)管極性以匹配目標(biāo)分析物的電荷。通常，堿性分析物通過接受質(zhì)子（M + H）⁺以正離子模式zui有效地電離，而酸性分析物通過提供質(zhì)子（MH）^-將在負(fù)離子模式中產(chǎn)生zui強(qiáng)的信號。然而，對于更復(fù)雜的分子，可能難以預(yù)測*極性模式。此外，分析物的行為和響應(yīng)因儀器平臺而異。因此，在初始方法開發(fā)期間或?qū)F(xiàn)有方法轉(zhuǎn)移到新儀器時，使用兩種極性模式篩選分析物是有益的^[6]。

        電離效率受流速，流動相組成和目標(biāo)分析物的物理化學(xué)性質(zhì)的強(qiáng)烈影響。毛細(xì)管電壓設(shè)置取決于分析物，洗脫液和流速，并且可能對方法重現(xiàn)性產(chǎn)生重大影響。毛細(xì)管和采樣板之間施加的電位差是維持穩(wěn)定和可重復(fù)噴霧的原因^[7]。如果毛細(xì)管電壓設(shè)置不正確，可能會出現(xiàn)可變電離和精度問題。*霧化氣體流量和溫度也取決于洗脫液。霧化氣體限制了液滴的生長，同時電荷累積并且還影響從毛細(xì)管發(fā)射的液滴的尺寸。應(yīng)增加霧化氣體流量和溫度以獲得更快的LC流速或使用高含水流動相時。類似地，干燥氣體流量和溫度對于LC洗脫液的有效去溶劑化和氣相離子的成功生產(chǎn)是關(guān)鍵的。需要注意的是，在分析熱不穩(wěn)定分析物時，必須注意防止其在源中降解。

        在電離源內(nèi)產(chǎn)生氣相離子的位置對于*傳輸?shù)組S系統(tǒng)是重要的。離子羽流的大小取決于發(fā)射氣相離子所需的裂變事件的數(shù)量及其與采樣孔的距離。通過基于LC流速調(diào)節(jié)毛細(xì)管相對于孔口的位置，可以優(yōu)化離子羽流的取樣。在更快的流速下，毛細(xì)管應(yīng)放置在離采樣孔更遠(yuǎn)的位置，以便進(jìn)行充分的去溶劑化和增加裂變事件的數(shù)量。盡管延長距離將允許產(chǎn)生更多數(shù)量的氣相離子，但排斥力也將成比例地增加，導(dǎo)致離子羽流的尺寸擴(kuò)大并且氣相離子的密度減小。結(jié)果是，進(jìn)入采樣孔的離子數(shù)量會減少，導(dǎo)致信號強(qiáng)度下降^[3]。在較慢的流速下，形成較小的液滴，使毛細(xì)管更靠近取樣孔。較小的液滴更容易去溶劑化并且需要更少的裂變事件，減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管和采樣孔之間的距離減小會增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率^[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管和采樣孔之間的距離減小會增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率^[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管和采樣孔之間的距離減小會增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率^[3]。

        如Szerkus及其同事分析尿液中7-甲基鳥嘌呤和葡萄糖醛酸所證明的，上述電離源參數(shù)的優(yōu)化可能會帶來2到3倍的靈敏度增益^[8]。在優(yōu)化源條件時，使用預(yù)期的LC流動相和流速非常重要。一種優(yōu)化方法是多次注入標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在每次注射時逐步改變特定的源參數(shù)。圖2展示了評估兩種農(nóng)藥*去溶劑化溫度的過程：甲an磷和甲氨基阿維菌素B1a苯甲酸鹽。通過將去溶劑化溫度從400℃提高到550℃，使甲an磷的響應(yīng)增加20％。相反，如果去溶劑化溫度超過500°C，由于該化合物的熱不穩(wěn)定性，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽B1a經(jīng)歷*信號損失。或者，可以通過將恒定流量的分析物引入LC洗脫液并監(jiān)測分析物TIC來優(yōu)化源條件。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡化該過程。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡化該過程。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡化該過程。

樣品預(yù)處理

        樣品預(yù)處理是LC-MS分析工作流程的重要組成部分，特別是在分析含有低濃度目標(biāo)分析物的復(fù)雜樣品時。去除非目標(biāo)樣品組分可以小化基質(zhì)干擾并改善目標(biāo)分析物的S / N比。與目標(biāo)分析物共洗脫的基質(zhì)化合物可能導(dǎo)致分析物信號的抑制或增強(qiáng); 這些干擾稱為矩陣效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)通常表現(xiàn)為MS靈敏度或特異性的損失，并且在ESI中普遍存在，因?yàn)樵诎l(fā)射氣相離子之前可能在液滴表面上發(fā)生電荷競爭。作為替代方案，如果感興趣的分析物是熱穩(wěn)定的并且具有中等極性^[1]，則可以使用大氣壓化學(xué)電離（APCI）。在APCI中，通過電暈針的施加電壓，LC洗脫液在電離之前*蒸發(fā)成氣體。然后電離的流動相蒸氣與分析物分子反應(yīng)產(chǎn)生帶電離子。基質(zhì)效應(yīng)在APCI中往往不那么廣泛，因?yàn)殡x子是通過氣相反應(yīng)而不是液相反應(yīng)產(chǎn)生的^[9]。

        可以使用各種樣品制備策略從潛在的干擾基質(zhì)組分中提取目標(biāo)分析物。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)取決于樣品基質(zhì)，樣品體積，目標(biāo)分析物濃度和分析物理化學(xué)性質(zhì)。如果樣品清潔并且已知含有高濃度的目標(biāo)分析物，簡單的過濾和稀釋是降低潛在干擾濃度的快捷方便的方法。另一方面，已知含有低目標(biāo)分析物濃度的復(fù)雜樣品將需要更嚴(yán)格的提取程序以改善信號強(qiáng)度。雖然由于需要投入的成本和時間，可能不需要更嚴(yán)格的樣品制備程序，無論選擇哪種樣品制備技術(shù)，重要的是要考慮基質(zhì)效應(yīng)可能是由于內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的存在。盡管樣品中已存在內(nèi)源性成分（蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，色素等），但在樣品預(yù)處理過程中將外源化合物引入樣品中。這些化合物可以從用于離心管，孔板和移液管的塑料中浸出，并且可以包括來自制造過程的副產(chǎn)物和殘余物（例如，模塑劑，增塑劑，穩(wěn)定劑和釋放劑）。污染物的數(shù)量和類型因制造商而異，如圖3a所示。在這個實(shí)驗(yàn)中，對7家制造商的聚合物固相萃?。⊿PE）反相96孔板提取的污染物進(jìn)行了比較。通過LC-MS分析提取物，并將得到的數(shù)據(jù)減去背景以除去溶劑和分析柱的貢獻(xiàn)。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開的一系列重復(fù)離子，在制造商C中清楚地識別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開的一系列重復(fù)離子，在制造商C中清楚地識別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開的一系列重復(fù)離子，在制造商C中清楚地識別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。
 

       外源化學(xué)品的其他來源包括玻璃器皿（特別是用清潔劑清潔時），非MS級溶劑和添加劑的使用，或可能從皮膚或周圍環(huán)境中引入化學(xué)品的粗心工作實(shí)踐。如果沒有適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室程序和仔細(xì)篩選樣品預(yù)處理產(chǎn)品，可能會無意中將污染物引入樣品中。如果樣品經(jīng)過濃縮步驟，可能會觀察到S / N比降低，因?yàn)榉治鑫锖臀廴疚锒紩粷饪s^[9]。

流動相組成

        流動相通過影響目標(biāo)分析物的保留和電離，在LC-MS靈敏度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用高純度溶劑和添加劑對于防止不需要的加合物形成和增加的MS背景是至關(guān)重要的。同樣，只有來自水凈化系統(tǒng)的超純水或適用于LC-MS的瓶裝水才能用于流動相制備。收集的MS級和HPLC級甲醇的LC-MS譜顯示HPLC級甲醇中的雜質(zhì)顯著增加，特別是在小分子分析中常見的低分子量范圍內(nèi)（圖4）。從該數(shù)據(jù)可以明顯看出，較低等級溶劑的使用如何有助于降低靈敏度和卷積光譜，使得定量或光譜解釋變得困難。
 

圖4 HPLC級甲醇和LC-MS級甲醇的平均光譜的比較。流動相：未指明的未改性甲醇; 流速：0.5 mL / min; 系統(tǒng)：采用ESI +電離的LC-MS; 掃描范圍：100-2000 m / z。

        將揮發(fā)性緩沖液和酸結(jié)合到流動相中使得能夠控制目標(biāo)分析物的電離狀態(tài)，從而可以操縱保留。分析物保留為LC-MS分析人員提供了幾個優(yōu)勢。，增加的分析物保留意味著在梯度LC期間從柱中洗脫分析物需要更高的有機(jī)溶劑濃度。已經(jīng)表明，具有較高有機(jī)濃度的液滴在MS源中更有效地去溶劑化，導(dǎo)致MS靈敏度提高^[11]。其次，更高的色譜選擇性使得可以避免可能對分析物響應(yīng)有害的共洗滌基質(zhì)效應(yīng)。通過同時輸注分析物后柱，同時通過分析柱^[12]進(jìn)行LC注入提取的空白基質(zhì)樣品，可以色譜監(jiān)測保留區(qū)域和基質(zhì)抑制。基質(zhì)抑制區(qū)域的特征在于分析物信號的減少。通過這種方式，可以調(diào)整分析物保留，以避免色譜圖中顯著抑制的區(qū)域。

        流動相緩沖液和酸也會影響電離效率。這種說法對于ESI尤其如此，因?yàn)橛捎陔婋x競爭，它易于降低檢測器響應(yīng)。為了降低緩沖液誘導(dǎo)抑制的可能性，通常應(yīng)將濃度保持在低限度。或者，含有甲酸的流動相可以使不需要的金屬加合物小化。由酸提供的質(zhì)子過量驅(qū)使大部分離子形成質(zhì)子化分子[M + H] ⁺，導(dǎo)致響應(yīng)的總體改善，因?yàn)樗辉俜植荚诙鄠€帶電物質(zhì)上^[12]。

        通過在酸離子改性劑的正離子模式下提供質(zhì)子或通過在負(fù)離子模式下接受基本改性劑的質(zhì)子，觀察到電離效率的提高。后者被證明是兩種中性雌激素，雌酮和雌三醇的負(fù)電離，當(dāng)它們在含有0.2％氫氧化銨的稀釋劑中制備時，與含有0.2％乙酸的雌激素相比，它們的響應(yīng)增加三倍^[14]。含氨的緩沖鹽（例如，甲酸銨或乙酸銨）可以提高極性中性化合物的電離效率，所述極性中性化合物不能通過形成銨加合物而自身電離。銨鹽可用于通過提供恒定的銨供應(yīng)來防止形成不需要的加合物。例如，兩種強(qiáng)心苷的LC-MS分析，地gao辛和洋地黃毒苷幾乎*用甲酸銨改性的流動相進(jìn)行。沒有甲酸銨，這些化合物傾向于形成鈉加合物，當(dāng)通過串聯(lián)MS分析時難以破碎^[14]。
 

LC柱特性

        對提高LC-MS靈敏度的渴望趨向于使用更小的顆粒（亞2μm）和減小的柱直徑（≤2.1mm）實(shí)施LC柱。與全多孔顆粒（FPP）相比，表面多孔顆粒（SPP）的引入允許提率，同時降低系統(tǒng)壓力。從理論上講，柱可以提高靈敏度; 但是，必須考慮LC-MS系統(tǒng)的柱外體積，電離效率和數(shù)據(jù)采樣率，以充分實(shí)現(xiàn)其優(yōu)勢。

        色譜柱提供窄色譜峰的能力表征為其效率（N），并由其板高（H）定義。峰的效率是其寬度和保留時間的函數(shù)。有幾個過程有助于色譜柱內(nèi)外的峰展寬。進(jìn)樣器，連接管和檢測器都是柱外峰展寬的來源。

        在色譜柱內(nèi)部，渦流擴(kuò)散（A），縱向傳質(zhì)（B）以及流動相和固定相傳質(zhì)（C）都有助于峰的色散。總的來說，這些術(shù)語構(gòu)成了van Deemter等式：

        其中h是降低板高度，v是流動相線速度^[2]。van Deemter方程作為比較柱性能的基礎(chǔ)。

        提高柱效的一種方法是減小粒徑。減小總峰寬將導(dǎo)致峰高的整體增加。假設(shè)探測器噪聲保持不變，較高的峰值會導(dǎo)致S / N的改善和靈敏度的提高。此外，峰可能更加分辨，降低了基質(zhì)干擾影響電離效率的可能性。

        較小的顆粒柱還允許使用更快的*線速度，并且通過擴(kuò)展，更快的流速 - 不會經(jīng)歷效率的顯著損失。不幸的是，由于控制ESI的機(jī)制，更快的流速通常不利于靈敏度，因?yàn)楸仨毘ニ邢疵撘翰拍艹晒π纬蓺庀嚯x子。雖然一些制造商聲稱儀器兼容洗脫液流速高達(dá)1 mL / min，但據(jù)報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)流量LC-ESI-MS系統(tǒng)的*性能發(fā)生在10-300μL/ min^[16]的范圍內(nèi)。為了適應(yīng)小顆粒及其相關(guān)的高線速度，2.1 mm內(nèi)徑色譜柱已成為標(biāo)準(zhǔn)流量LC-ESI-MS系統(tǒng)的首xuan尺寸，*流速為200-300μL/ min。

        改變顆粒形態(tài)是提高柱效的另一種方法。表面多孔顆粒與全多孔顆粒的不同之處在于它們具有圍繞實(shí)心核的薄多孔殼。它們能夠顯著提率，因?yàn)榭v向擴(kuò)散（B）和渦流擴(kuò)散（A）的減少是由于它們的粒徑分布窄，滲透性降低和外表面粗糙^[17]。圖5使用van Deemter圖比較了全多孔3-μmC18色譜柱與相同尺寸的表面多孔2.7-μmC18色譜柱的動力學(xué)性能。與全多孔顆粒相比，表面多孔柱的效率提高了60％。
 

圖5 Van Deemter圖比較3-μm全多孔C18柱和2.7-μm表面多孔C18柱之間的效率。流動相A：45％水; 流動相B：55％乙腈; 檢測：光電二極管陣列，254 nm; 注射量：1μL; 樣品：在25:75乙腈 - 水中制備的0.03mg / mL聯(lián)苯。

        利用內(nèi)徑較窄的色譜柱可zui大限度地減少分析物稀釋，這在色譜分離過程中會發(fā)生。由于柱上稀釋，分析物靈敏度與濃度依賴性檢測器^[18]的柱內(nèi)徑的平方成反比。因此，假設(shè)在兩種情況下都可以注入相同體積的樣品，理論上將2.1 mm內(nèi)徑色譜柱切換到0.3 mm內(nèi)徑色譜柱可以將靈敏度提高50倍^[19]。同樣，較小的內(nèi)徑柱保持相同的線速度和降低的流速，這在電離效率方面是有益的。在這些流量下，對于需要高靈敏度且樣品量有限的應(yīng)用，使用非常慢的流速（每分鐘納升）已經(jīng)變得流行。

        將窄孔柱與質(zhì)譜聯(lián)用時，有幾個含義。柱內(nèi)徑的減小與效率的提高一起導(dǎo)致峰值體積的顯著降低。在不使儀器中的柱外體積小化的情況下，柱性能將受到損害，使得難以實(shí)現(xiàn)靈敏度的任何顯著增加。大多數(shù)柱外體積貢獻(xiàn)可歸因于LC系統(tǒng)，MS貢獻(xiàn)可忽略不計(jì)。然而，發(fā)現(xiàn)用于將LC柱與MS系統(tǒng)連接的管道是關(guān)鍵的，因?yàn)樵摴艿牢挥谥?，其中不會發(fā)生補(bǔ)償譜帶展寬的聚焦效應(yīng)^[20]。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，柱外體積不應(yīng)超過色譜圖中窄峰的峰值體積的三分之一^[21]。例如，1.8μm，100 mm×2.1 mm色譜柱的峰容積約為8μL^[16]。因此，zui大柱外體積應(yīng)小于3μL，以抵消系統(tǒng)相關(guān)的效率損失。

        較小的峰值體積也意味著需要快速采集速率來收集定量數(shù)據(jù)所需峰值的小15-20個數(shù)據(jù)點(diǎn)。與時間相關(guān)的譜帶展寬效應(yīng)可能是由于停留時間不足和數(shù)據(jù)平滑過度造成的。在圖6中，使用三種掃描速率（300ms，50ms和5ms）分析嗎啡和氫嗎啡酮。人工展寬對于300毫秒的數(shù)據(jù)是明顯的，而5毫秒的數(shù)據(jù)顯示過度采樣的過度噪聲。不正確的停留時間設(shè)置會對數(shù)據(jù)質(zhì)量和信噪比產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。此外，在分析大量化合物時，通過在選擇離子監(jiān)測（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下收集數(shù)據(jù)可以實(shí)現(xiàn)更長的循環(huán)時間，以減少與時間相關(guān)的譜帶展寬效應(yīng)的發(fā)生。
 

圖6 采集的數(shù)據(jù)與（a）300 ms，（b）50 ms和（c）5 ms的停留時間的比較，以及它們對時間相關(guān)頻帶展寬的貢獻(xiàn)。系統(tǒng)：LC-MS / MS; 極性：ESI +。峰值：1 =嗎啡，2 =氫嗎啡酮。

結(jié)論

        開發(fā)靈敏且穩(wěn)健的LC-MS方法是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。為了解其目標(biāo)分析物的物理化學(xué)性質(zhì)，以及MS電離和傳輸效率的機(jī)制和局限性，分析人員可以開始做出明智的決策，以優(yōu)化總體響應(yīng)。提高靈敏度的簡單，zui有效的方法是優(yōu)化電離源條件，以確保zui大限度地生產(chǎn)和將氣相離子轉(zhuǎn)移到MS系統(tǒng)中。可以通過使用、窄孔LC柱，較慢的LC流速，仔細(xì)選擇樣品預(yù)處理程序改善響應(yīng)以及減少可能導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)和基線噪音的干擾從而降低檢測限。
 

參考

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